|
| |
|
|
Rekombinantní příprava DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD1 pro studium jeho interakcí s DNA
Kúdelová, Veronika ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Proteiny TEAD patří do významné rodiny transkripčních faktorů, které se během vývoje organismu podílí na regulaci jeho růstu a diferenciace buněk prostřednictvím aktivace exprese nejrůznějších genů. Tato rodina sdílí dvě vysoce konzervovaná místa, a to TEA DNA vazebnou doménu, po které tyto proteiny získaly název, a doménu, pomocí níž transkripční faktory váží další koaktivátory. Protože TEAD proteiny nejsou samy o sobě schopné transkripce, interagují s řadou koaktivátorů, které umožňují regulovat transkripci požadovaného genu. Poruchou regulace aktivity TEAD proteinů může docházet ke vzniku nádorových onemocnění. Proto v dnešní době hrají proteiny rodiny TEAD nemalou roli při vývoji nových protinádorových léčiv. Jedním ze způsobů inhibice těchto proteinů je zabránění jejich vazbě na DNA, tedy blokace aktivního místa v DNA vazebné doméně. Tato bakalářská práce se zabývá rekombinantní expresí zmíněné DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD1, která je prodloužená o aminokyseliny v nestrukturované oblasti. Po nalezení vhodných podmínek produkce bylo přistoupeno k produkci ve velkém objemu následované purifikací a ověřením identity proteinu. Nakonec byla potvrzena schopnost interakce produkovaného proteinu s DNA. Připravený protein bude tedy možné využít ke studiu způsobů jeho interakce s DNA,...
|
|
|
Rekombinantní příprava DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD4
Zákopčaník, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
5 Abstrakt Transkripční faktory TEAD hrají důležitou roli v řízení buněčného růstu a diferenciace. Jejich deregulace je spojována s řadou nádorových onemocnění. Proteiny TEAD rozpoznávají DNA pomocí vysoce konzervované DNA vazebné domény. Ta by mohla představovat slibný cíl terapeutického zásahu pro budoucí protinádorová léčiva. Cílem této diplomové práce byla produkce DNA vazebné domény transkripč- ního faktoru TEAD4 prodloužená o nestrukturovanou variabilní část spojující tuto doménu s transaktivační doménou. Jako purifikační kroky byla využita afinitní chromatografie a gelová permeační chromatografie. Následně byl produkovaný protein charakterizován pomocí hmotnostní spektrometrie. Konečným krokem bylo použití nativní elektroforézy k ověření schopnosti produkovaného proteinu vázat DNA. V průběhu purifikace byla pozorována fragmentace produkovaného pro- teinu od C-konce. Na základě analýzy spektra z hmotnostní spektrometrie byly popsány tři nejzastoupenější fragmenty produkovaného proteinu. První z forem (55 %) obsahovala aminokyseliny 30-131 proteinu TEAD4, druhá nejzastoupenější forma (18 %) obsahovala aminokyseliny 30-144 a třetí forma (16 %) obsahovala aminokyseliny 30-81. Na závěr byla u produkovaného proteinu potvrzena schop- nost vazby DNA, účinnost však byla nižší než očekávaná. Do budoucna je...
|
|
|
Rekombinantní příprava DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD1 pro studium jeho interakcí s DNA
Kúdelová, Veronika ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Proteiny TEAD patří do významné rodiny transkripčních faktorů, které se během vývoje organismu podílí na regulaci jeho růstu a diferenciace buněk prostřednictvím aktivace exprese nejrůznějších genů. Tato rodina sdílí dvě vysoce konzervovaná místa, a to TEA DNA vazebnou doménu, po které tyto proteiny získaly název, a doménu, pomocí níž transkripční faktory váží další koaktivátory. Protože TEAD proteiny nejsou samy o sobě schopné transkripce, interagují s řadou koaktivátorů, které umožňují regulovat transkripci požadovaného genu. Poruchou regulace aktivity TEAD proteinů může docházet ke vzniku nádorových onemocnění. Proto v dnešní době hrají proteiny rodiny TEAD nemalou roli při vývoji nových protinádorových léčiv. Jedním ze způsobů inhibice těchto proteinů je zabránění jejich vazbě na DNA, tedy blokace aktivního místa v DNA vazebné doméně. Tato bakalářská práce se zabývá rekombinantní expresí zmíněné DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD1, která je prodloužená o aminokyseliny v nestrukturované oblasti. Po nalezení vhodných podmínek produkce bylo přistoupeno k produkci ve velkém objemu následované purifikací a ověřením identity proteinu. Nakonec byla potvrzena schopnost interakce produkovaného proteinu s DNA. Připravený protein bude tedy možné využít ke studiu způsobů jeho interakce s DNA,...
|
|
|
Model pro studium regulace transkripce granulocytarních genů MPO a MMP9 rozdílnými koncentracemi transkripčního faktoru PU.1
Chramostová, Kamila ; Pospíšil, Vít (vedoucí práce) ; Kleibl, Zdeněk (oponent)
7 Abstrakt Enhancery jsou distální cis - regulační sekvence DNA, které regulují (zesilují) transkripci genu řízenou z promotoru. Enhancery se nacházejí v nekódující DNA před, či za genem nebo v intronech či kódujících oblastech vzdálených až mnoho kilobází od genu. Superenhancery jsou nově objevená seskupení mnohočetných enhancerů, které hrají zásadní úlohu při aktivaci tkáňově specifických genů, určení buněčné identity a indukci diferenciace. PU.1 je transkripční faktor (TF) nezbytný pro normální krvetvorbu, konkrétně pro vývoj myeloidní a lymfoidní krevní řady. Přesná koncentrace PU.1 je zodpovědná za diferenciaci krvetvorných buněk do odlišných buněčných linií a jejich narušení vede k leukemogenezi. Vysoké koncentrace PU.1 stimulují makrofágový vývoj, zatímco střední koncentrace stimulují vývoj granulocytů. Jakými regulačními mechanismy je zajištěno, že granulocytární geny jsou aktivovány výhradně ve střední koncentrací PU.1, zatímco makrofágové ve vysoké, je zajímavá biologická otázka, k jejímuž zodpovězení se snaží přispět i tato diplomová práce. Cílem této diplomové práce bylo vytvořit sérii reportérových vektorů nesoucí regulační oblasti granulocytárních genů MPO a MMP9, které by umožnily studium mechanismů, jak jsou různé koncentrace TF PU.1 vnímány regulačními sekvencemi cílových genů. Na základě...
|
|
|
Regulation of expression of Ms1, a sRNA from Mycobacterium smegmatis
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
V průběhu růstu musí bakterie čelit různým vlivům prostředí, jako jsou změna teploty, nedostatek živin a jiné. Při adaptaci na nepříznivé podmínky dochází u bakterií k přizpůsobení genové exprese. Jedním typem regulace genové exprese je regulace pomocí malých nekódujících RNA (sRNA). Dobře studovanou bakteriální sRNA je 6S RNA, která se váže na holoenzym RNA polymerázy. Avšak tato RNA byla nalezena jen u některých druhů baterií. Jedním z druhů, které pravděpodobně nemají 6S RNA jsou mykobakterie. Místo toho byla u Mycobacterium smegmatis nalezena jiná malá RNA - Ms1. Ms1 má strukturu podobnou 6S RNA a skutečně byla původně nalezena jako strukturní homolog 6S RNA. Ukázalo se však, že Ms1 se neváže na holoenzym RNA polymerázy, ale váže se na jádro RNA polymerázy. Jedná se proto o malou RNA významně odlišnou od 6S RNA. Tato práce popisuje regulaci exprese Ms1. Z regulační oblasti před genem pro Ms1 byli připraveny promotorové fragmenty různé délky. Tyto fragmenty byly vloženy před reportérový gen lacZ. Aktivita těchto promotorů byla testována v exponenciální, časné a pozdní stacionární fázi růstu a v průběhu stresu. Na základě provedených experimentů byla určena sekvence promotorového jádra a regulační oblasti, do kterých by se mohl vázat transkripční faktor. Aktivita promotoru pro Ms1 se zvýšila při...
|
host ::
RSS.